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[文獻(xiàn)精讀] 如何鑒定游離DNA的身份
2017-08-24 00:00來源：原版作者：Jerry Li
血液中的游離DNA（cfDNA）是液體活檢的首要關(guān)注點(diǎn)。 為了精準(zhǔn)檢測這些游離的DNA片段, 我們就需要關(guān)注游離DNA的基本特征，比如濃度、片段大小、序列、穩(wěn)定性等【1-4】。 但是更重要的問題，是怎樣鑒定這些游離DNA的身份。 身份指導(dǎo)行為。 比如說我們有了新同事或是新鄰居，好奇的我們首先想要知道新人的身份，從哪里來，以前做過什么，這樣基本可以預(yù)測這人的行為。根據(jù)同樣的思路，我們關(guān)注游離DNA的身份，即它們從哪里來，到哪里去， 哪些是靶向DNA, 哪些是干擾DNA, 哪些DNA在哪些生理環(huán)境下有哪些生物學(xué)行為。這些知識(shí)無疑會(huì)幫助我們?cè)O(shè)計(jì)更新更好的，來穩(wěn)定、保護(hù)和檢測游離DNA。
在液態(tài)活檢的科研領(lǐng)域，我們可以借助目前已經(jīng)建立了的模型，來總結(jié)游離DNA的行為特征，從而鑒定其身份。在這里我們重點(diǎn)討論血液凝集系統(tǒng)和創(chuàng)傷系統(tǒng)， 這兩個(gè)系統(tǒng)的特點(diǎn)是它們都有非常訊速變化的血液環(huán)境。 這樣的環(huán)境里， 游離DNA的水平處于顯著的動(dòng)態(tài)變化中，這就為我們提供了非常獨(dú)特和寶貴的視角，為我們闡釋了游離DNA身份提供了依據(jù)。
1．從血液凝集看游離DNA動(dòng)態(tài)變化
血漿和血清作為最常見的血液樣品，分別是采血系統(tǒng)的抗凝和促凝的產(chǎn)物，它們內(nèi)含的游離DNA的水平有很大差異【5-12】。 在配對(duì)對(duì)比試驗(yàn)中，科研人員對(duì)同一患者的血樣在其他條件都對(duì)等的條件下， 對(duì)比分析了血漿樣品和血清樣品，發(fā)現(xiàn)血清里的游離DNA的水平是血漿的14倍【5】到20倍【6】。 這里指的是新鮮血清和血漿的比對(duì)，如果觀察貯存的樣品，人們發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)的游離DNA水平在穩(wěn)步上升， 在4°C的環(huán)境里保存5天的血清樣本，游離DNA的水平可以在本底基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高100倍，而同等條件下的血漿里游離DNA的水平基本不變【6】。
由于血清是血液凝集后的產(chǎn)物，一系列的級(jí)聯(lián)凝集反應(yīng)導(dǎo)致血小板富集，化學(xué)介質(zhì)釋放，核酸以及核酸酶釋放，這些都是導(dǎo)致血清中DNA水平的變化的可能原因。 我們已經(jīng)知道的是，血清中升高的DNA有相當(dāng)部分是來自白細(xì)胞中釋放的基因組DNA。 這些DNA不僅量很高，水平和化學(xué)性質(zhì)也很不穩(wěn)定【13-15】。 更重要的是，對(duì)于液體活檢項(xiàng)目中我們關(guān)注的靶分子，比如無創(chuàng)產(chǎn)檢中的胎兒DNA, 血清中的量反而比血漿中更少【16】。 這很可能來自于白細(xì)胞釋放的DNA酶對(duì)于游離DNA的降解作用。
2．血清不適合做液體活檢的樣品
液體活檢樣品的大忌就是（1）相關(guān)DNA的量小，（2）無關(guān)DNA的量大。 這兩點(diǎn)在血清中都體現(xiàn)出來了。 那么血清是否是不適合做液體活檢的樣品？ 我們來看看腫瘤監(jiān)測的情況，因?yàn)槟[瘤監(jiān)測相對(duì)于產(chǎn)檢、創(chuàng)傷監(jiān)測這些常規(guī)檢查，腫瘤監(jiān)測的難度更大，是液體活檢的終極挑戰(zhàn)。在【17】肺癌患者的血漿對(duì)血清的配對(duì)對(duì)比實(shí)驗(yàn)中，血漿檢測可以看出患者的游離DNA的量顯著地高于健康人（24.5ng/mL vs 5.1ng/mL）, 而血清檢測的結(jié)果顯示肺癌患者和健康人的游離DNA水平是一樣的。 也就是說，在液態(tài)活檢的高難度項(xiàng)目中，使用血漿是比血清能更有效地檢出腫瘤的存在。 液體活檢的樣品準(zhǔn)備對(duì)結(jié)果有直接影響，血清樣品因?yàn)槠涓咚降幕蚪MDNA以及核酸酶，給液體活檢的靶分子檢測提高了難度，因而不適合做液體活檢。
我們同時(shí)應(yīng)該看到，血液樣品中的游離DNA是處于動(dòng)態(tài)變化的， 即便是血漿樣品，它內(nèi)部的游離DNA水平也在穩(wěn)步提高。 同樣是血漿樣品，在常規(guī)采血管（比如EDTA管）中的游離DNA可能比特殊采血管（比如BCT）中高上百倍【18】。 所以對(duì)于液體活檢的樣品處理，使用細(xì)胞穩(wěn)定劑來穩(wěn)定血液細(xì)胞，是保護(hù)cfDNA是根本的解決辦法【19-23】。關(guān)于血細(xì)胞的穩(wěn)定和血液樣品貯存運(yùn)輸，可以參照我們的《液體活檢通訊-2017.6： 樣本處理對(duì)cfDNA和液體活檢的影響 》。
3. 從創(chuàng)傷看游離DNA的消長
如果說血清樣品中游離DNA變化是局部的、人為促成的，那么創(chuàng)傷（trauma）過程中游離DNA變化則反映了整體的、有機(jī)的變化，所以能更加有信服力第說明游離DNA的動(dòng)態(tài)和來源。 根據(jù)對(duì)創(chuàng)傷患者的檢測，患者血液中游離DNA的水平是無一例外是升高的【24-35】。 經(jīng)典的研究發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷發(fā)生的20分鐘內(nèi)，血液中游離DNA的水平就能夠被檢出有顯著升高【24】。如果患者的創(chuàng)傷情況在幾小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定下來，游離DNA的水平就會(huì)穩(wěn)定并開始下降， 反之如果患者情況惡化并最終導(dǎo)致器官衰竭， 游離DNA的水平會(huì)持續(xù)保存在高點(diǎn)上，最長的可以達(dá)到28天。根據(jù)創(chuàng)傷的種類和嚴(yán)重程度， 游離DNA的水平也不同，所以游離DNA的水平是創(chuàng)傷預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。這些觀察涵蓋了多種創(chuàng)傷，包括外科手術(shù)、開放性傷口、灼傷、化學(xué)燒傷等，這些創(chuàng)傷都看到了游離DNA水平的迅速升高。在2017年的一份綜述文章里， 人們列舉了14個(gè)針對(duì)創(chuàng)傷ICU的臨床研究，共計(jì)904名患者， 結(jié)論是在創(chuàng)傷病例中，高水平的游離DNA和高死亡率是顯著相關(guān)的【35】。
更多的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于創(chuàng)傷導(dǎo)致的肺損傷、呼吸壓力癥的患者，相對(duì)于最終沒有引發(fā)這些并發(fā)癥的患者，他們的游離DNA的水平要高12倍【25】。刺穿創(chuàng)傷的患者的游離DNA水平高于鈍擊創(chuàng)傷的患者，并發(fā)感染的患者的游離DNA水平高于比沒有感染的患者【26】。在創(chuàng)傷患者的系統(tǒng)里，不僅核源的游離DNA水平升高，線粒體DNA的水平也升高【28】。這些結(jié)果也進(jìn)一步說明，游離DNA和機(jī)體應(yīng)急狀態(tài)密切相關(guān)，和凝血過程密切相關(guān)。
4. 游離DNA參與機(jī)體防御和凝血
細(xì)胞的死亡，無論是正常細(xì)胞的凋亡，還是癌細(xì)胞的死亡，都會(huì)造成游離DNA的量增【35-40】。 加上人們對(duì)血液凝集過程以及創(chuàng)傷的觀察，很自然地推論出游離DNA的來源是細(xì)胞死亡造成的。 進(jìn)一步的推論很可能就是，游離DNA只是死亡細(xì)胞的釋放產(chǎn)物，雖然它有重要的示蹤作用，可以幫助鑒別癌細(xì)胞、胚胎細(xì)胞，但游離DNA是被動(dòng)的、沒有功能的細(xì)胞廢物， 在血樣中逐漸減少并消失呢， 實(shí)際情況是否是這樣呢？ 實(shí)際情況總是復(fù)雜得多。
根據(jù)對(duì)血液白細(xì)胞和凝血的細(xì)致研究，人們發(fā)現(xiàn)游離DNA是中性粒胞外陷阱（neutrophil extracellular traps， 簡稱NET）的重要組成部分【41-51】 。 中性粒胞外陷阱是近年來新發(fā)現(xiàn)的免疫防御系統(tǒng)，在外來病原體（比如細(xì)菌）或是免疫信號(hào)的刺激下，中性粒細(xì)胞會(huì)釋放出特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來纏在病原體，防止其擴(kuò)散和增生。 這個(gè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就是中性粒胞外陷阱， 是由游離DNA、組蛋白和抗微生物蛋白組成的【41】。 沒有游離DNA就不會(huì)形成中性粒胞外陷阱， 如果用DNA酶來降解DNA會(huì)導(dǎo)致 中性粒胞外陷阱的失活。 這在客觀上解釋了為什么正常人，無論多么健康，都是有一定水平的游離DNA, 因?yàn)橛坞xDNA是機(jī)體防御的一部分。
對(duì)中性粒胞外陷阱的研究還發(fā)現(xiàn)， 這些網(wǎng)結(jié)構(gòu)可以刺激凝血和血栓的形成【42】。 在動(dòng)物模型里，人為提高游離DNA的水平，可以直接刺激凝血酶-抗血栓酶復(fù)合物的發(fā)生和增長， 表明游離DNA很可能參與了某種凝血刺激信號(hào)。 在由病原體激活的全血樣品中，游離DNA的主要來源是中性粒細(xì)胞。 中性粒胞外陷阱在形成血栓后導(dǎo)致中性粒細(xì)胞死亡，同時(shí)釋放游離DNA。 這個(gè)過程不同于通過細(xì)胞凋亡來是否游離DNA，因?yàn)闆]有它沒有導(dǎo)致DNA長鏈的斷裂【44】。
我們知道凝血和血栓過程是機(jī)體自我保護(hù)的一種機(jī)制，但同時(shí)它在某些病理情況下也是對(duì)機(jī)體有傷害作用。無論是保護(hù)和傷害， 游離DNA參與凝血和血栓都說明，游離DNA不只是被動(dòng)的、沒有功能的細(xì)胞成分， 而是細(xì)胞功能的一部分，是細(xì)胞的工具并可以被主動(dòng)調(diào)控。 至于游離DNA是怎樣被調(diào)控的，并用怎樣的機(jī)理來調(diào)控血凝和血栓，現(xiàn)在人們的知識(shí)還很有限。 隨著液體活檢領(lǐng)域的科研和臨床研究的展開， 游離DNA在正常生理環(huán)境下的身份，一定會(huì)更加清晰。
參考文獻(xiàn)
|
1 |
Chan KC et al. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem. 2004 Jan;50(1):88-92. |
|
|
|
2 |
Heitzer E et al. Circulating Tumor DNA as a liquid Biopsy for cancer Clinical Chemistry. 2015 61:1 112-123 |
|
|
|
3 |
Perakis S et al. Advances in Circulating Tumor DNA Analysis Adv Clin Chem. 2017;80:73-153 |
||
|
4 |
Wan JC et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA Nat Rev Cancer. 2017 Apr;17(4):223-238 |
|
|
|
5 |
Lui YY et al. Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation. Clin Chem. 2002 Mar;48(3):421-7. |
|
|
|
6 |
Lee TH et al. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 2001 Feb;41(2):276-82 |
|
|
|
7 |
Thijssen MA et al. Difference between free circulating plasma and serum DNA in patients with colorectal liver metastases. Anticancer Res. 2002 Jan-Feb;22(1A):421-5. |
|
|
|
8 |
Lo YM et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am J Hum Genet. 1998 Apr;62(4):768-75. |
|
|
|
9 |
Lui YY et al. Circulating DNA in plasma and serum: biology, preanalytical issues and diagnostic applications. Clin Chem Lab Med. 2002 Oct;40(10):962-8. |
|
|
|
10 |
Gautschi O et al. Circulating deoxyribonucleic Acid as prognostic marker in non-small-cell lung cancer patients undergoing chemotherapy. J Clin Oncol. 2004 Oct 15;22(20):4157-64. |
|
|
|
11 |
Nie K et al. Cell-free circulating tumor DNA in plasma/serum of non-small cell lung cancer. Tumour Biol. 2015 Jan;36(1):7-19. |
|
|
|
12 |
Chan KC et al. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin Chem. 2005 Apr;51(4):781-4. |
|
|
|
13 |
Lo YM et al. Circulating nucleic acids in plasma and serum: an overview. Ann N Y Acad Sci. 2001 Sep;945:1-7. |
|
|
|
14 |
van der Vaart M et al. Is the role of circulating DNA as a biomarker of cancer being prematurely overrated? Clin Biochem. 2010 Jan;43(1-2):26-36. |
|
|
|
15 |
Zinkova A et al. Cell-free DNA from human plasma and serum differs in content of telomeric sequences and its ability to promote immune response. Sci Rep. 2017 Jun 1;7(1):2591. |
|
|
|
16 |
Wong FC et al. Cell-free DNA in maternal plasma and serum: A comparison of quantity, quality and tissue origin using genomic and epigenomic approaches. Clin Biochem. 2016 Dec;49(18):1379-1386. |
|
|
|
17 |
Board RE et al. Isolation and extraction of circulating tumor DNA from patients with small cell lung cancer. Ann N Y Acad Sci. 2008 Aug;1137:98-107. |
|
|
|
18 |
Norton SE et al. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR. Clin Biochem. 2013 Oct;46(15):1561-5. |
|
|
|
19 |
Perakis S et al. Advances in Circulating Tumor DNA Analysis Adv Clin Chem. 2017;80:73-153 |
||
|
20 |
Warrino DE et al. Stabilization of white blood cells and immunologic markers for extended analysis using flow cytometry. J Immunol Methods. 2005 Oct 30;305(2):107-19. |
|
|
|
21 |
Fernando MR et al. A new methodology to preserve the original proportion and integrity of cell-free fetal DNA in maternal plasma during sample processing and storage. Prenat Diagn. 2010 May;30(5):418-24. |
|
|
|
22 |
Wong D et al. Optimizing blood collection, transport and storage conditions for cell free DNA increases access to prenatal testing. Clin Biochem. 2013 Aug;46(12):1099-104 |
|
|
|
23 |
Das K et al. Effects of a novel cell stabilizing reagent on DNA amplification by PCR as compared to traditional stabilizing reagents. Acta Histochem. 2014 Jan;116(1):55-60. |
|
|
|
24 |
Lam NY et al. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients. Clin Chem. 2003 Aug;49(8):1286-91. |
|
|
|
25 |
Lo YM et al. Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients. Clin Chem. 2000 Mar;46(3):319-23 |
|
|
|
26 |
Ren B et al. Is plasma cell-free DNA really a useful marker for diagnosis and treatment of trauma patients? Clin Chim Acta. 2013 Sep 23;424:109-13. |
|
|
|
27 |
Saukkonen K et al. Association of cell-free plasma DNA with hospital mortality and organ dysfunction in intensive care unit patients. Intensive Care Med. 2007 Sep;33(9):1624-7. |
|
|
|
28 |
Chou CC et al. Plasma nuclear DNA and mitochondrial DNA as prognostic markers in corrosive injury patients. Dig Surg. 2008;25(4):300-4. |
|
|
|
29 |
Letendre JA et al. Measurement of plasma cell-free DNA concentrations in dogs with sepsis, trauma, and neoplasia. J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). 2017 May;27(3):307-314. |
|
|
|
30 |
Ahmed AI et al. Cell Free DNA and Procalcitonin as Early Markers of Complications in ICU Patients with Multiple Trauma and Major Surgery. Clin Lab. 2016 Dec 1;62(12):2395-2404. |
|
|
|
31 |
Rainer TH et al. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Ann N Y Acad Sci. 2001 Sep;945:211-20. |
|
|
|
32 |
Fox A et al. Quantification of circulating cell-free plasma DNA and endothelial gene RNA in patients with burns and relation to acute thermal injury. Burns. 2008 Sep;34(6):809-16. |
|
|
|
33 |
Ahmed AI et al. Elevated cell-free plasma DNA level as an independent predictor of mortality in patients with severe traumatic brain injury. J Neurotrauma. 2014 Oct 1;31(19):1639-46. |
|
|
|
34 |
Gould TJ et al. Extracellular DNA and histones: double-edged swords in immunothrombosis. J Thromb Haemost. 2015 Jun;13 Suppl 1:S82-91. |
|
|
|
35 |
G?genur M et al. The role of total cell-free DNA in predicting outcomes among trauma patients in the intensive care unit: a systematic review. Crit Care. 2017 Jan 24;21(1):14. |
|
|
|
36 |
Fournié GJ et al. Plasma DNA as cell death marker in elderly patients. Gerontology. 1993;39(4):215-21. |
|
|
|
37 |
Wijeratne S et al. Cell-free plasma DNA as a prognostic marker in intensive treatment unit patients. Ann N Y Acad Sci. 2004 Jun;1022:232-8. |
|
|
|
38 |
Fournié GJ et al. Plasma DNA as a marker of cancerous cell death. Investigations in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearing human tumours. Cancer Lett. 1995 May 8;91(2):221-7. |
|
|
|
39 |
Korzeneva IB et al. Human circulating plasma DNA significantly decreases while lymphocyte DNA damage increases under chronic occupational exposure to low-dose gamma-neutron and tritium β-radiation. Mutat Res. 2015 Sep;779:1-15. |
|
|
|
40 |
Opatrna S et al. Cell-free plasma DNA during Hemodialysis. Ren Fail. 2009;31(6):475-80. |
||
|
41 |
Brinkmann V et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 2004 Mar 5;303(5663):1532-5. |
|
|
|
42 |
Swystun LL et al. Breast cancer chemotherapy induces the release of cell-free DNA, a novel procoagulant stimulus. J Thromb Haemost. 2011 Nov;9(11):2313-21. |
|
|
|
43 |
Gould TJ et al. Neutrophil extracellular traps promote thrombin generation through platelet-dependent and platelet-independent mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2014 Sep;34(9):1977-84. |
|
|
|
44 |
Fuchs TA et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 2007 Jan 15;176(2):231-41. |
|
|
|
45 |
Jiménez-Alcázar M et al. Circulating Extracellular DNA: Cause or Consequence of Thrombosis? Semin Thromb Hemost. 2017 Mar 30. |
|
|
|
46 |
Kim SJ et al. Role of platelets in neutrophil extracellular trap (NET) production and tissue injury. Semin Immunol. 2016 Dec;28(6):546-554. |
|
|
|
47 |
Jansen MP et al. Release of extracellular DNA influences renal ischemia reperfusion injury by platelet activation and formation of neutrophil extracellular traps. Kidney Int. 2017 Feb;91(2):352-364. |
|
|
|
48 |
Gould TJ et al. Cell-Free DNA Modulates Clot Structure and Impairs Fibrinolysis in Sepsis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2015 Dec;35(12):2544-53. |
|
|
|
49 |
Andrews RK et al. Neutrophil extracellular traps (NETs) and the role of platelets in infection. Thromb Haemost. 2014 Oct;112(4):659-65. |
|
|
|
50 |
Schneck E et al. Plasma DNA and RNA differentially impact coagulation during abdominal sepsis-an explorative study. J Surg Res. 2017 Apr;210:231-243. |
|
|
|
51 |
Fournié GJ et al. Extracellular DNA and histones: double-edged swords in immunothrombosis. J Thromb Haemost. 2015 Jun;13 Suppl 1:S82-91. |
|
|
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